前言

维生素B1又称硫胺素或抗神经炎维生素或抗脚气病维生素，由嘧啶环和噻唑环通过亚甲基结合而成的一种B族维生素。维生素B1主要存在于种子的外皮和胚芽中，如米糠和麸皮中含量很丰富，在酵母菌中含量也极丰富。瘦肉、白菜和芹菜中含量也较丰富。所用的维生素B1都是化学合成的产品。在体内，维生素B1以辅酶形式参与糖的分解代谢，有保护神经系统的作用；还能促进肠胃蠕动，增加食欲。维生素B1缺乏时，可引起多种神经炎症，如脚气病。维生素B1缺乏所引起的多发性神经炎，患者的周围神经末梢有发炎和退化现象，并伴有四肢麻木、肌肉萎缩、心力衰竭、下肢水肿等症状。在现代医学上，维生素B1制剂治疗脚气病和多种神经炎症有显著疗效。

实验部分

仪器、试剂与材料

主要仪器设备

高效液相色谱仪-荧光检测器

试剂材料

正丁醇、铁氰化钾、氢氧化钠、盐酸、乙酸钠、氯化钙均为分析纯；

冰乙酸、甲醇为色谱纯

维生素B1标准品（纯度99%）：盐酸硫胺素，CAS 67-03-8；

木瓜蛋白酶：应不含维生素B1，酶活力≥800 U（活力单位）/mg；

淀粉酶：应不含维生素B1，酶活力≥3700 U/g；

20 g/L铁氰化钾溶液：称取2 g铁氰化钾，用水溶解并定容至100 mL，摇匀；

100 g/L氢氧化钠溶液：称取25 g氢氧化钠，用水溶解并定容至250 mL，摇匀；

碱性铁氰化钾溶液：将5 mL上述铁氰化钾溶液与200 mL上述氢氧化钠溶液混合，摇匀；

0.1 mol/L盐酸溶液：移取8.5 mL盐酸，加水稀释至1000 mL，摇匀；

0.01 mol/L盐酸溶液：量取0.1 mol/L盐酸溶液50 mL，用水稀释并定容至500 mL，摇匀；

0.05 mol/L乙酸钠溶液：称取6.08 g乙酸钠，加900 mL水溶解，用冰乙酸调节pH为4.0 ~ 5.0之间，加水定容至1000 mL，经0.45 µm微孔滤膜过滤后使用；

2.0 mol/L乙酸钠溶液：称取27.2 g乙酸钠，用水溶解并定容至100 mL，摇匀；

混合酶溶液：称取1.76 g木瓜蛋白酶、1.27 g淀粉酶，加水定容至50 mL，涡旋，使呈混悬状液体，冷藏保存。

样品制备

样品提取

称取3 g ~ 5 g固体试样或者10 g ~ 20 g液体试样于100 mL锥形瓶中（带有软质塞子），加60 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，充分摇匀，塞上软质塞子，高压灭菌锅中121℃保持30 min。水解结束待冷却至40℃取出，轻摇数次，用2.0 mol/L乙酸钠溶液调节pH至4.0左右，加入2 mL（可根据酶活力不同适当调整用量）混合酶溶液，摇匀后，置于培养箱中37℃过夜（约16 h），将酶解液全部转移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，离心或者过滤，取上清液备用。

样品衍生化

准确移取上述上清液或者滤液2 mL于10 mL试管中，加入1 mL碱性铁氰化钾溶液，涡旋混匀后，准确加入2 mL正丁醇，再次涡旋混匀1.5 min后静置约10 min或者离心，待充分分层后，吸取正丁醇相（上层）经0.45 µm微孔滤膜过滤，取滤液于2 mL棕色进样瓶中，待检测。若样品中维生素B1浓度超出线性范围的最高浓度值，应取上清液稀释适宜倍数后，重新衍生后进样。

实验条件

液相条件

色谱柱：Venusil® XBP C18(2)  5 µm， 4.6 × 250 mm，100 Å

流动相：0.05 mol/L乙酸钠溶液︰甲醇 = 65︰35

荧光检测器检测波长：激发波长375 nm，发射波长435 nm

流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL

结果与讨论

实验结果

经图1、图2可知，采用Venusil XBP C18(2)色谱柱检测婴幼儿配方奶粉中的维生素B1，峰形良好，保留时间稳定，能够满足实验要求。

图1 维生素B1标准溶液

图2 婴幼儿配方奶粉中的维生素B1

结论

本实验依据GB 5009.84-2016第一法，用Venusil XBP C18(2)（5 µm，100 Å，4.6 × 250 mm）检测婴幼儿配方奶粉中的维生素B1，并结合液相色谱-荧光检测器对样品进行了检测，结果维生素B1保留时间稳定，峰形良好，说明Venusil XBP C18(2)（5 µm，100 Å，4.6 × 250 mm）能够用于婴幼儿配方奶粉中维生素B1的检测。

注意事项

按照国标法进行样品前处理时回收率较低，可采用先热超声提取，再经过酸沉淀蛋白后直接衍生化的方法加以改善。热超声时要注意温度的控制，以防止维生素B1遭到破坏。

因维生素B1为强极性化合物实验中应注意流动相比例的确定，且流动相的pH对出峰时间影响较大，因此在每次开始实验前，要调节流动相pH 值到相同的值。

附：相关产品

应用编号：AF10010