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类固醇激素又称为甾体激素，是内分泌细胞分泌的高效能生物化学物质。它们在维持生命、调节机体物质代谢、促进性器官发育和维持生育等方面起着重要作用。
类固醇激素在体内的含量较低，对其准确定量具有重要意义。本实验采用Cleanert® PEP 96微孔板对血清样品进行净化，建立了血清中类固醇激素的检测方法，该方法适合高通量样品前处理。
目标物信息
表1 化合物结构
|
化合物 |
英文名 |
CAS |
分子量 |
结构 |
|
氢化可的松 |
Hydrocortisone |
50-23-7 |
362.46 |
|
|
睾酮 |
Testosterone |
58-22-0 |
288.42 |
|
|
黄体酮 |
Progesterone |
57-83-0 |
386.5244 |
|
|
醛固酮 |
Aldosterone |
52-39-1 |
360.44 |
|
|
脱氢表雄酮 |
Dehydroepiandrosterone |
53-43-0 |
288.4 |
|
材料及仪器
Cleanert PEP 96微孔板(5mg/1mL)；96孔板正压装置；96位接收板；Venusil ASB C18（2.1*50mm，3μm，150 Å）；API 4000+。
样品处理方法
样品预处理
100μL血清样品与100μL 含有1%甲酸的甲醇/水溶液混合（50/50，v/v）
SPE过程
活化：依次用200μL甲醇、200μL水活化；
上样：将预处理过的血清样品上样至96孔板中；
淋洗：加入400μL甲醇/水(35/65, v/v)用于淋洗样品中的干扰物；
洗脱：加入200μL 1%甲酸甲醇，用96位收集板收集洗脱液用于LC-MS/MS检测。（将洗脱液氮吹浓缩可获得更低的检测限）
仪器检测条件
HPLC条件
色谱柱：Venusil ASB C18（2.1*50mm，3μm，150Å）
流速：200μL/min
柱温：30℃
进样量：3μL
流动相：0.1%甲酸水/0.1%甲酸乙腈（ 40/ 60，v/v）
质谱条件
扫描模式：电喷雾电离正模式
采集模式：多反应监测（MRM）
表2 参数信息
|
ID |
tR/min |
Q1 |
Q3 |
DP |
CE |
|
氢化可的松 |
0.98 |
363.2 |
120.9 |
74 |
40 |
|
363.2 |
327.2 |
70 |
23 |
||
|
睾酮 |
1.66 |
289.4 |
97.1 |
100 |
31 |
|
289.4 |
109.1 |
90 |
40 |
||
|
醛固酮 |
0.98 |
361.3 |
325.3 |
84 |
30 |
|
361.3 |
315.4 |
77 |
29 |
||
|
脱氢表雄酮 |
1.66 |
289.4 |
253.4 |
70 |
24 |
|
289.4 |
213.1 |
71 |
23 |
||
|
黄体酮 |
3.15 |
315.4 |
97.1 |
95 |
35 |
|
315.4 |
109.1 |
95 |
39 |
结果
图1 30ppb类固醇激素标准溶液色谱图
图2 血清样品色谱图
图3 血清加标样色谱图（浓度为30ppb）
表3 加标回收率数据
|
加标浓度 |
醛固酮 |
氢化可的松 |
睾酮 |
脱氢表雄酮 |
黄体酮 |
|
30ppb |
85.9% |
87.0% |
105.5% |
110.6% |
97.7% |
结论
在临床检验中类固醇激素是一个难点。本实验使用Cleanert® PEP 96孔板提取血清中的类固醇，加快了检测速度，相较免疫法提高了最低检测浓度，回收率高于85%，可满足实验室检测相关物质的需要。
订货信息表
|
产品名称 |
规格/包装 |
订货号 |
|
Cleanert PEP |
96微孔板，5mg/1mL |
PE00501-MW |
|
Cleanert M96 生物样品前处理仪 |
与96孔板匹配 |
SPE-M96 |
|
Cleanert V96 氮吹浓缩仪 |
与96孔板匹配 |
NV-96G |
|
96位接收板 |
1mL，与96孔板匹配 |
96SP1036-Y |
|
Venusil ASB C18 |
2.1*50mm，3μm,150 Å |
VS930502-0 |
|
甲醇 |
HPLC，4*4L |
AH230-4 |
|
乙腈 |
HPLC，4*4L |
AH015-4 |
|
水 |
LC-MS级，4*2.5L/箱 |
LC365 |
应用编号：YB10007
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