河北来复医药科技有限公司
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背景
溶血磷脂酰胆碱（lyso-Phosphatidylcholines,LPCs）是磷脂的一种，具有多种生理功能，与糖尿病、动脉粥样硬化、血脂异常等代谢性疾病和心血管疾病密切相关。LPCs主要在肝脏代谢，在肝脏疾病和肝毒性中可发生明显变化；近年来，学者们对多种肝脏疾病和化学性肝毒性模型的大量研究均涉及了LPCs。
本应用案例介绍一种液相色谱-串联质谱的方法，采用Cleanert PPT 96孔板净化人血清样品，从血清样品中富集LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0五种溶血磷脂酰胆碱，该方法具有良好的稳定性及可靠性，可为溶血磷脂酰胆碱临床研究提供一种解决方案。
材料及仪器
Cleanert PPT 蛋白沉淀板，Cleanert M96 生物样品前处理仪，Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪，96孔收集板，Durashell C18(L)（3.0*50 mm, 5 μm,150Å），以上产品均为天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；LC-MS/MS, API 4000+（SCIEX）；LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0（以上5种标准品购自Avanti）；利血平(内标)；甲醇；甲酸；水；生理盐水（0.9%）；甲酸铵。
样品处理方法
样品混合
由于难以获得不含目标物的基质，本实验使用生理盐水代替人血清进行方法学验证试验。为保护人血中溶血磷脂酰胆碱，试验中使用的甲醇均含有0.1% 2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）。
标准曲线及重现性试验中，基质为生理盐水，试验中取20μL生理盐水，加入5μL 标准工作液，涡旋混合均匀，待下一步净化。
人血清加标试验中，取20μL血清，加入5μL 标准工作液，涡旋混合均匀，待下一步净化。
蛋白沉淀过程
先向Cleanert PPT每孔中加入150μL甲醇（含100ppb利血平），再加入预混合的样品，涡旋混合均匀，静置10min，使用Cleanert M96将溶液收集至洁净收集板内。
Cleanert V96温度设定为30℃，将收集板里的溶液氮吹干，使用1mL 80%甲醇水复溶，涡旋混合均匀，进样测试。
仪器检测条件
HPLC条件
色谱柱：Durashell C18(L) （3.0*50mm 5um 150Å）
流速：800uL/min
柱温：30℃
进样量：5 μL
流动相条件
|
Total Time(min) |
0.1%甲酸25mM甲酸铵-水 (%) |
0.1%甲酸-甲醇(%) |
|
0 |
70 |
30 |
|
0.5 |
50 |
50 |
|
1 |
0 |
100 |
|
4 |
0 |
100 |
|
4.1 |
70 |
30 |
|
5 |
STOP |
|
质谱条件
扫描模式：电喷雾电离正模式
采集模式：多反应监测（MRM）
表2 参数信息
|
目标物 |
tR/min |
Q1 |
Q3 |
DP |
CE |
|
利血平 |
2 |
609.3 |
448.2 |
140 |
40 |
|
609.3 |
195* |
120 |
45 |
||
|
C14:0 |
2.46 |
468.4 |
285.3 |
110 |
40 |
|
468.4 |
450.4* |
120 |
27 |
||
|
C15:0 |
2.54 |
482.3 |
299.5 |
120 |
36 |
|
482.3 |
464.2* |
120 |
28 |
||
|
C16:0 |
2.63 |
496.4 |
478.2* |
124 |
16 |
|
C17:0 |
2.72 |
510.4 |
327.2 |
120 |
30 |
|
510.4 |
492.4* |
120 |
20 |
||
|
C18:0 |
2.83 |
524.5 |
341.5 |
115 |
28 |
|
524.5 |
506.2* |
127 |
18 |
注：*为定量离子对
结果
线性范围与灵敏度为考察方法线性范围，配置系列标准工作液，取5μL标准工作液至20μL生理盐水中进行前处理操作，获得的样品浓度参见 3中S1~S7，曲线方程等信息参见表3.
表3 标准曲线浓度及线性关系
|
项目 |
C14:0 |
C15:0 |
C16:0 |
C17:0 |
C18:0 |
|
S1/ppm |
0.125 |
0.25 |
3.75 |
0.375 |
2.5 |
|
S2/ppm |
0.25 |
0.5 |
7.5 |
0.75 |
5 |
|
S3/ppm |
0.5 |
1 |
15 |
1.5 |
10 |
|
S4/ppm |
1.25 |
2.5 |
37.5 |
3.75 |
25 |
|
S5/ppm |
2.5 |
5 |
75 |
7.5 |
50 |
|
S6/ppm |
3.75 |
7.5 |
112.5 |
11.25 |
75 |
|
S7/ppm |
7.5 |
15 |
225 |
22.5 |
150 |
|
曲线方程 |
y=0.725x+0.00264 |
y=0.212x-0.0256 |
y=0.212x+0.268 |
y=0.366x+0.00653 |
y=0.31x+0.287 |
|
相关系数 |
0.9965 |
0.9913 |
0.9956 |
0.9938 |
0.9961 |
|
LOQ/ppm |
0.027 |
0.12 |
0.32 |
0.059 |
0.072 |
方法精密度与准确度
实验中取生理盐水为基质，进行两个浓度（S3，S5）的加标回收率实验，分别进行两个平行样，结果见表4.
为考察方法精密度与准确度，取浓度水平为S3与S5分别进行8个样品的平行试验，S3对应LQC，S5对应HQC，基质为生理盐水，实验获得的数据见表5。
表4 生理盐水基质加标回收率数据
|
项目 |
C14:0 |
C15:0 |
C16:0 |
C17:0 |
C18:0 |
|
低加标浓度/ppm |
1.25 |
2.5 |
37.5 |
3.75 |
25 |
|
高加标浓度/ppm |
3.75 |
7.5 |
113 |
11.3 |
75 |
|
低-实测浓度-1/ppm |
1.29 |
2.28 |
38.1 |
3.31 |
24.3 |
|
低-实测浓度-2/ppm |
1.44 |
2.85 |
43 |
4.09 |
28.1 |
|
低-回收率-1 |
103.2% |
91.2% |
101.6% |
88.3% |
97.2% |
|
低-回收率-2 |
114.4% |
114.0% |
114.7% |
109.1% |
112.4% |
|
高-实测浓度-1/ppm |
3.44 |
6.77 |
102 |
9.83 |
69.9 |
|
高-实测浓度-2/ppm |
3.35 |
6.53 |
103 |
9.94 |
69 |
|
高-回收率-1 |
91.7% |
90.3% |
90.3% |
87.0% |
93.2% |
|
高-回收率-2 |
89.3% |
87.1% |
91.2% |
88.0% |
92.0% |
表5 生理盐水基质精密度与准确度数据
|
项目 |
C14:0 |
C15:0 |
C16:0 |
C17:0 |
C18:0 |
|
LQC平均回收率(n=8) |
96.3% |
99.9% |
103.6% |
96.6% |
100.0% |
|
CV(n=8) |
6.3% |
6.4% |
8.5% |
7.1% |
7.0% |
|
HQC平均回收率(n=8) |
96.8% |
99.1% |
97.5% |
93.8% |
97.7% |
|
CV(n=8) |
11.3% |
12.1% |
12.3% |
12.0% |
11.3% |
由表4及表5可见，此方法可用于处理及检测生理盐水基质中的溶血磷脂酰胆碱，为进一步考察方法对于血清样本的适应性，特取人血清进行加标回收率考察，获得数据见表6.由于人血清中含有浓度可观的溶血磷脂酰胆碱，实验检测两份人血清样品用于扣除内源性溶血磷脂酰胆碱，加标回收率计算公式为：
CA—加标样实测浓度
CM—人血清样品平均浓度
CS—加标浓度
表6 人血清基质实验数据
|
项目 |
C14:0 |
C15:0 |
C16:0 |
C17:0 |
C18:0 |
|
低加标浓度/ppm |
1.25 |
2.5 |
37.5 |
3.75 |
25 |
|
高加标浓度/ppm |
3.75 |
7.5 |
113 |
11.3 |
75 |
|
人血清样品-1/ppm |
0.827 |
2.46 |
107 |
2.92 |
47.3 |
|
人血清样品-2/ppm |
0.678 |
2.21 |
92 |
2.45 |
39.4 |
|
低-实测浓度-1/ppm |
1.97 |
4.5 |
140 |
6.24 |
72 |
|
低-实测浓度-2/ppm |
2.17 |
4.99 |
136 |
6.67 |
70 |
|
低-回收率-1 |
97.4% |
86.6% |
108.0% |
94.8% |
114.6% |
|
低-回收率-2 |
113.4% |
106.2% |
97.3% |
106.3% |
106.6% |
|
高-实测浓度-1/ppm |
4.8 |
9.46 |
196 |
13.8 |
113 |
|
高-实测浓度-2/ppm |
4.72 |
9.69 |
216 |
14.8 |
122 |
|
高-回收率-1 |
107.9% |
95.0% |
85.4% |
98.4% |
92.9% |
|
高-回收率-2 |
105.3% |
98.1% |
103.1% |
107.2% |
104.9% |
图1 标准曲线S2点色谱图
图2 人血样品色谱图
实验结论
本应用使用蛋白沉淀的方式对生理盐水及人血清进行前处理，并使用LC-MS/MS检测溶血磷脂酰胆碱，结果表明本方法简单、稳定、易操作，可快速处理检测人血清中溶血磷脂酰胆碱含量，用于临床研究。
实验所用产品列表
|
产品名称 |
规格/包装 |
订货号 |
|
Cleanert PPT |
96孔板，1mL/well |
96CD1025-M |
|
Cleanert M96 生物样品前处理仪 |
与96孔板匹配 |
SPE-M96 |
|
Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪 |
与96孔板匹配 |
NV-96G |
|
96孔收集板 |
2mL/well，与96孔板匹配 |
96SP2036-Y |
|
Durashell C18(L) |
3.0*50mm，5μm，150Å |
DC950503-L |
|
甲醇 |
LC-MS级, 4*2.5L |
LC230 |
|
水 |
LC-MS级，4*2.5L/箱 |
LC365 |
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