河北来复医药科技有限公司
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糖皮质激素是临床常用的一类药物，对皮肤病有良好的消炎作用，可抑制纤维细胞增生，减少5-羟色胺的形成，因此其在短时间使用对皮肤有一定的嫩白作用【1】。但长期使用则会发生皮肤变薄、毛细血管扩张、毛囊萎缩，一旦停用，皮肤就会发红、发痒，出现红斑、皮疹等。因此我国《化妆品卫生规范》【2】明确规定此类物质为禁用成分。目前糖皮质激素的检测多集中在药品中有效成分和尿液中糖皮质激素的检测【3-7】，化妆品中糖皮质激素的检测文献报道的较少。本文采用CLearnert PEP-2 SPE净化的方法，建立了一种化妆品中泼尼松、泼尼松龙、可的松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、醋酸可的松、醋酸泼尼松、醋酸氢化可的松、曲安奈德11种糖皮质激素同时检测的方法。
实验方法
.实验试剂和材料
糖皮质激素类药物标准品（详见表1）
表1 糖皮质激素类药物标准品信息
|
中文名 |
英文名 |
CAS号 |
相对分子质量 |
|
泼尼松龙 |
Prednisone |
50-24-8 |
360.1937 |
|
氢化可的松 |
Hydrocortisone |
50-23-7 |
362.2093 |
|
泼尼松 |
Prednisone |
53-03-2 |
358.1780 |
|
可的松 |
Cortisone |
53-06-5 |
360.1937 |
|
甲基泼尼松龙 |
MethyLprednisoLone |
83-43-2 |
374.2093 |
|
倍他米松 |
Betamethasone |
378-44-9 |
392.1999 |
|
地塞米松 |
Dexamethasone |
50-02-2 |
392.1999 |
|
曲安奈德 |
TriamcinoLone acetonide |
76-25-5 |
434.2105 |
|
氢化可的松醋酸酯 |
Hydrocortisone 21-acetate |
50-03-3 |
404.2200 |
|
泼尼松醋酸酯 |
Prednisone 21-acetate |
125-10-0 |
400.1886 |
|
可的松醋酸酯 |
Cortisone 21-acetate |
50-04-4 |
402.2042 |
实验试剂（详见表2）
|
试剂名称 |
品牌 |
规格 |
|
甲醇 |
霍尼韦尔 |
质谱纯，2.5L/瓶 |
|
乙腈 |
霍尼韦尔 |
质谱纯，2.5L/瓶 |
|
水 |
霍尼韦尔 |
质谱纯，2.5L/瓶 |
仪器和设备（详见表3）
|
设备名称 |
品牌 |
规格/型号 |
|
串联质谱仪 |
AB SCIEX |
API 4000+ |
|
高效液相色谱仪 |
安捷伦 |
1260 |
|
VenusiLTM ASB C18液相色谱柱 |
天津博纳艾杰尔科技 |
2.1×150mm 3µm 150A |
|
分析型柱温箱 |
天津博纳艾杰尔科技 |
>室温5℃~70℃ |
|
12位固相萃取装置 |
天津博纳艾杰尔科技 |
12位 |
|
CLeanertTM PEP-2 固相萃取小柱 |
天津博纳艾杰尔科技 |
500 mg/6 mL |
|
针式过滤器（尼龙） |
天津博纳艾杰尔科技 |
0.22 um，13 mm |
|
分析天平 |
赛多利斯 |
0.1mg，220g |
|
高速离心机 |
上海华亭 |
50mL*6 |
|
涡旋振荡器 |
Vortex-genie |
230/240VAC 50HZ |
|
氮吹仪 |
天津博纳艾杰尔科技 |
15位 |
糖皮质激素类药物标准溶液配制
标准贮备液
分别精密称取适量的12种糖皮质激素标准品，用甲醇溶解定容，分别配制成1 000μg/mL的贮备液。-20℃以下保存。
混合标准工作液
准确量取糖皮质激素类药物标准贮备液适量，用20%乙腈水溶液稀释成适宜浓度的混合标准工作液，现配现用。
实验试剂的配置
10%亚铁氰化钾溶液：称量2.3g K4Fe(CN)6•3H2O，用水溶解定容至20mL；
20%乙酸锌溶液：称量4.78g C4H6O4Zn•2H2O，用水溶解定容至20mL；
定容液：量取70mL水和30mL乙腈，混匀后加入100uL甲酸混匀。
测定步骤
提取
霜膏类化妆品：称取0.2 g试样于50mL离心管，混匀。加入3 mL饱和氯化钠溶液，涡旋混合使样品分散，加入2mL乙腈，超声提取5 min，8000 r/min离心5 min，吸取上层清液于另一50 mL离心管中，下层氯化钠溶液用2mL乙腈重复提取一次，合并二次乙腈提取液，往提取液加入40mL去离子水，混匀，加入亚铁氰化钾溶液0.2mL，混匀，加入乙酸锌溶液0.2mL，混匀，8000r/min离心10min，作为待进化液。
精油类样品：称取0.5g试样（精确至0.01g）于50 mL离心管，混匀。加入4 mL正己烷，涡旋混合使样品分散，加入4 mL 50%乙腈水溶液，涡旋提取2 min，8000 r/min离心5min，吸取下层提取液，上层正己烷用4 mL 50%乙腈水溶液重复上述提取步骤一次，合并二次50%乙腈提取液，往提取液加入36 mL去离子水，混合，加入亚铁氰化钾溶液0.1mL，混匀，加入乙酸锌溶液0.1mL，混匀，8000r/min离心10 min，作为待进化液。
净化
将PEP-2固相萃取小柱接上固相萃取装置，小柱上端紧密连接一个60 mL装有筛板的上样管，小柱预先用5 mL甲醇、10 mL水活化。将上述待净化液全部上样，待样品溶液自然流尽后，再用10 mL 10%乙腈水溶液淋洗小柱，待清洗液自然流尽后，取下上样管，用吸球吹出小柱中的残留液。用6mL甲醇洗脱小柱，待甲醇自然流尽后，用吸球吹出小柱中的残留液，收集洗脱液于40℃氮气吹干，用1 mL定容液溶解定容，过0.22 um尼龙滤膜，待测。
液相色谱条件
色谱柱：VenusiL ASB C18，3μm，150 Å，2.1*150mm；
流动相：A相：含0.1%甲酸的水溶液；B相：含0.1%甲酸的乙腈溶液；
梯度洗脱程序见表4；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
表4 流动相梯度洗脱条件和流速
|
时间/min |
流速/μL/min |
A相/% |
B相/% |
|
0.00 |
200 |
68 |
32 |
|
3.00 |
200 |
68 |
32 |
|
10.00 |
200 |
25 |
75 |
|
15.00 |
200 |
15 |
85 |
|
15.01 |
200 |
68 |
32 |
|
25.00 |
200 |
68 |
32 |
质谱条件
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；
IS：-4500V；
GS1：55Psi；
GS2：55Psi；
TEM：550℃；
糖皮质激素类药物多反应监测的优化参数见表5。
表5 糖皮质激素类药物多反应监测的优化参数
|
药物名称 |
保留时间/min |
监测离子对 |
DP |
EP |
CE |
CXP |
|
泼尼松龙 |
6.22 |
405.1/329.1 |
-40 |
-10 |
-20 |
-9 |
|
|
|
405.1/359.2 |
-40 |
-10 |
-20 |
-9 |
|
氢化可的松 |
6.35 |
407.2/331.1 |
-30 |
-10 |
-22 |
-9 |
|
|
|
407.2/361.1 |
-30 |
-10 |
-22 |
-9 |
|
泼尼松 |
6.29 |
403.1/326.9 |
-50 |
-10 |
-18 |
-9 |
|
|
|
403.1/357.2 |
-50 |
-10 |
-18 |
-9 |
|
可的松 |
6.66 |
405.1/329.1 |
-40 |
-10 |
-20 |
-9 |
|
|
|
405.1/359.2 |
-40 |
-10 |
-20 |
-9 |
|
甲基泼尼松龙 |
9.02 |
419.2/343.0 |
-40 |
-10 |
-22 |
-9 |
|
|
|
419.2/373.0 |
-40 |
-10 |
-22 |
-9 |
|
倍他米松 |
9.55 |
437.2/361.3 |
-60 |
-10 |
-22 |
-1 |
|
|
|
437.2/391.1 |
-65 |
-10 |
-22 |
-1 |
|
地塞米松 |
10.04 |
437.2/361.3 |
-60 |
-10 |
-22 |
-1 |
|
|
|
437.2/391.1 |
-65 |
-10 |
-22 |
-1 |
|
曲安奈德 |
12.22 |
479.1/413.4 |
-60 |
-10 |
-24 |
-11 |
|
|
|
479.1/337.1 |
-40 |
-10 |
-24 |
-11 |
|
氢化可的松醋酸酯 |
12.9 |
449.2/403.0 |
-50 |
-10 |
-16 |
-11 |
|
|
|
449.2/373.0 |
-50 |
-10 |
-16 |
-11 |
|
泼尼松醋酸酯 |
13.42 |
447.2/401.1 |
-45 |
-10 |
-18 |
-9 |
|
|
|
447.2/371.2 |
-50 |
-10 |
-18 |
-9 |
|
可的松醋酸酯 |
12.30 |
445.2/339.1 |
-40 |
-10 |
-16 |
-9 |
|
|
|
445.2/369.3 |
-45 |
-10 |
-16 |
-9 |
注：带"____"的监测离子对为定量离子对。
结果与讨论
净化条件的选择
目前文献报道的净化方法多选用聚合物基质的吸附性材料或硅胶基质的ODS SPE小柱。本文选用CLeanert PEP-2 SPE小柱，实验结果表明其可同时对11种糖皮质激素有很好的吸附。
考察了不同体积分数0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%乙腈的水溶液的洗脱效果，结果表明使用10%乙腈的水溶液，可保证11种糖皮质激素不被洗脱下来，所以最终选用10%乙腈的水溶液做淋洗液，并且在上样之前要用水将乙腈的提取液稀释。
液相色谱柱的选择
在本文要同时检测的11种糖皮质激素中，可的松和氢化可的松、倍他米松和地塞米松为同分异构体，在反相液相色谱中比较难分离。通过比较不同C18的分离效果，最终选用VenusiLASB C18（3μm，150Å，2.1 × 150mm）为色谱柱，可保证11种糖皮质激素在15min内均达到基线分离。
线性关系和检出限
将浓度分别为2、5、10、20和50μg/L的混合标准溶液依次进样分析，以峰面积Y对浓度X（μg/L）拟合回归方程，结果见表6。结果表明，11种糖皮质激素分别在2-50μg/L范围内呈线性，相关系数r大于0.999，检出限（S/N=3）为
表6 11种糖皮质激素线性回归方程和检出限
|
药物名称 |
线性方程 |
r |
|
泼尼松 |
Y=16724X-210.43 |
0.9991 |
|
泼尼松龙 |
Y=23142-11999 |
0.9992 |
|
可的松 |
Y=16727-9533.1 |
0.9998 |
|
氢化可的松 |
Y=11244X+692.17 |
0.9992 |
|
甲基泼尼松龙 |
Y=16312X-15347 |
0.9992 |
|
倍他米松 |
Y=10695X-6738.1 |
0.9994 |
|
地塞米松 |
Y=22636-9558 |
0.9994 |
|
可的松醋酸酯 |
Y=8486.7X+2690.1 |
0.9994 |
|
泼尼松醋酸酯 |
Y=10652X-7839.4 |
0.9997 |
|
氢化可的松醋酸酯 |
Y=4372X-2405.8 |
0.9995 |
|
曲安奈德 |
Y=4062.9X-29840 |
0.9992 |
准确度和重现性
以市售玫瑰精油和护手霜为基质，进行添加回收实验，进行0.1μg/g和0.05μg/g添加浓度的实验，11种糖皮质激素的回收率均在75%-120%之间，具体实验结果请见下列表格：
表7 玫瑰精油0.1μg/g添加回收实验结果
|
药物名称 |
平行1 |
平行2 |
平行3 |
平均回收率 |
RSD |
|
泼尼松 |
85.19% |
85.65% |
76.98% |
82.61% |
5.90% |
|
泼尼松龙 |
91.68% |
90.70% |
81.07% |
87.82% |
6.68% |
|
可的松 |
93.67% |
92.11% |
82.38% |
89.39% |
6.84% |
|
氢化可的松 |
84.56% |
89.38% |
86.89% |
86.94% |
2.77% |
|
甲基泼尼松龙 |
94.08% |
82.90% |
84.75% |
87.24% |
6.87% |
|
倍他米松 |
89.74% |
90.28% |
80.51% |
86.84% |
6.33% |
|
地塞米松 |
103.10% |
93.90% |
89.10% |
95.37% |
7.46% |
|
可的松醋酸酯 |
87.19% |
87.40% |
92.02% |
88.87% |
3.07% |
|
泼尼松醋酸酯 |
119.07% |
119.86% |
111.63% |
116.85% |
3.89% |
|
氢化可的松醋酸酯 |
91.12% |
91.69% |
87.43% |
90.08% |
2.57% |
|
曲安奈德 |
98.72% |
84.57% |
87.15% |
90.14% |
8.36% |
表8玫瑰精油0.05μg/g添加回收实验结果表
|
药物名称 |
平行1 |
平行2 |
平行3 |
平均回收率 |
RSD |
|
泼尼松 |
78.32% |
75.44% |
86.69% |
80.15% |
7.29% |
|
泼尼松龙 |
85.75% |
85.75% |
86.16% |
85.88% |
0.28% |
|
可的松 |
86.99% |
77.29% |
88.46% |
84.25% |
7.20% |
|
氢化可的松 |
72.36% |
69.15% |
75.04% |
72.18% |
4.08% |
|
甲基泼尼松龙 |
84.80% |
88.74% |
99.95% |
91.16% |
8.62% |
|
倍他米松 |
76.19% |
85.32% |
95.32% |
85.61% |
11.18% |
|
地塞米松 |
80.38% |
79.99% |
90.64% |
83.67% |
7.22% |
|
醋酸酯可的松 |
86.52% |
93.17% |
107.36% |
95.68% |
11.13% |
|
泼尼松醋酸酯 |
119.39% |
107.72% |
111.49% |
112.87% |
5.28% |
|
氢化可的松醋酸酯 |
94.54% |
110.02% |
103.75% |
102.77% |
7.58% |
|
曲安奈德 |
94.10% |
73.98% |
90.74% |
86.27% |
12.49% |
|
|
|
|
|
|
|
9护手霜0.1μg/g添加回收实验结果
实验结论
使用CLeanertTM PEP-2、VenusiLTM ASB C18建立了一种化妆品中11种糖皮质激素同时检测的分析方法，实验结果表明本方法快速、准确，可用于化妆品中糖皮质激素的检测。
参考文献
【1】郑星泉，周淑玉，周世伟。化妆品卫生检验手册。北京：化学工业出版社，2003.294
【2】化妆品卫生规范。2007.34
【3】左志辉，周建玉，左文坚。药物分析杂志。2004,24（4）：420
【4】张林，孙子林。中国药物与临床。2006,6（1）：76
附图
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